Submitted by: sdemir   Date: 2009-11-16 11:14
BOYALAR
Prof.Dr. Bengül DURMAZ

Boyalar doğal ve sentetik olmak üzere iki gruba ayrılır:

a. Doğal boyalar: Doğal boyalar bitkisel ve hayvansal orijinli olabilirler. Bunlardan bitkisel orijinli olanlara hematoksilen ve orcein, hayvansal orijinli olanlara ise carmen örnek gösterilebilir.Doğal boyalar daha ziyade histolojide kullanılmaktadır.

b. Sentetik boyalar: Bunların sayıları oldukca çoktur. Eosin, asit fuksin, asit pikrik, oranj gelb, eritrosin, kongo kırmızısı, light green, metilen mavisi, toluidin mavisi, bazik fuksin, jansiyan viyole, azocarmen, safranin gibi birçok boya sentetik boyalara örnek gösterilebilir.

Sentetik boyalar ; Ehrlich tarafından bazik , asid ve nötr boyalar diye üç gruba ayrılmıştır.Serbest asid ve bazlar suda çok az eridiklerinden sentetik boyalar daima nötr tuzlar halinde kullanılırlar. Nötr tuzlar hem asit köke (anion) hem de bazik köke ( kation) sahiptirler.

a. Bazik boyalar: Bazik boyaların kromofor grubu pozitif yüke sahiptir. Yani, yukardaki açıklamanın ışığında, bu nötr tuzu meydana getiren bazik kısım (kation , +) renkli buna karşın asid kısım (anion, -) ise renksizdir. Bu tür boyalara katyonik boyalar da denir.

( Örneğin; metilen mavisi bazik bir boyadır ve terkibi tetramethhyl-thionin-chlorhydrate’tır. Bu terkipte tetramethyl-thionin baz’ı hidroklorik asit ile nötr bir tuz meydana getirecek şekilde birleşmiştir. Tetramethyl-thionin bazı renklidir ve metilen mavisi boyasına rengini verir, anion kökü olan hidroklorik asit ise renksizdir.) Bismarck brown y, crystal violet, methyl green , pararosanilin ( basic fuchsin), resorcin blue diğer bazik boyalara örnek verilebilir. Bir doğal boya olan hematoksilen de bazik boya tarzında davranır. Bakterilerin yüzeyi negatif olduğu için ayrıca DNA’da bulunan fosfatların da negatif yüklü olması nedeniyle katyonik özelliğe sahip olan bazik boyalarla boyanırlar.

b. Asid boyalar : Asid boyaların boyayıcı kısımları negatif elektriksel yüke sahiptir. Yani burada tuzun baz kısmı renksiz asid kısmı ise renklidir. Bu tür boyalara anyonik boyalar da denir. Asitik boyalar zemini boyamak için kullanılmaktadır.

Örneğin; sodium eozinat da eozinat negatif yüklü olup kromofor özelliktedir. Diğer asidik boyalara acid fuchsin, anilin blue, kongo red, fast green, light green, erytrosin, orange G, acid pikrik, Phyloxine, alizarin red S, çini mürekkebi, nigrosin, malaşit yeşili gibi boyalar örnek gösterilebilir.

c. Nötr boyalar: Nötr boyalar iyonik olmayan boyalardır. Bunlar suda çözünen renkli organik bileşiklerdir. Burada nötr tuzu meydana getiren asid ve bazın her ikiside renklidir. Hematoloji ve mikrobiyolojide sık kullanılan bu boyalara Giemsa boyası en güzel örnektir.Bu boyalar parazitlerin incelenmesinde , rikettsiya ve klamidyaların boyanmasında kullanılmaktadırlar.Wright ve Leisman boyalarıda bu tip boyalara örnektir.
BOYANMAYACAK PREPARATLARIN HAZIRLANMASI VE

İNCELENMESİ

Boyasız preparatlar daha çok bakteri hareketlerinin gözlenmesi, varsa protozoon kist ve trofozoitleri ve parazit yumurtalarının incelenmesi amaçları için kullanılır. Hareket muayenesi iki şekilde yapılabilir.

1-Lam lamel arası preparat: Hareket muayenesi yapılacak mikroorganizmanın sıvı kültürü yapılmalıdır. Preparat hazırlanırken lam mutlaka temiz olmalıdır. Absolu alkole batırılıp temizlenebilir.Ayrıca alevden geçirilerekte temizlenebilir. Sonra temiz bezle silinir. Lamın ortasına bir damla bakteri süspansiyonu damlatılır, üzerine lamel kapatılır, kuruması önlenmek istenilirse lamelin etrafı, çepeçevre sıvı vazelin veya tırnak cilası ile sıvanır. Önce 10 luk sonra 40 lık objektiflerle incelenir. Hareket incelemesi sırasında dikkat edilmesi gereken husus gerçek hareket yada Brownier hareket olup olmadığıdır. Brownier hareket hep aynı yöne suyun akış yönüne doğru olan harekettir.

2-Asılı damla preparatı ile hareket incelenmesi: Bu iş için ortasında bir çukur bulunan çukurlu lam kullanılır. Sıvı örnekten (bakteri süspansiyonu) öze ya da pastör pipeti ile alınan örnek temiz bir lamelin ortasına bırakılır. Lamel ters çevrilerek lamdaki çukura kapatılır, etrafı vazelinlenir.10x ve 40x objektiflerle inceleme yapılarak hareket izlenir. Hareket muayenesi için en uygun mikroskop karanlık alan mikroskopisidir.

Mikroorganizmaların hareketini gözlemek için dikkat edilmesi gereken birtakım kurallar vardır :

1- Klinik örnek alınır alınmaz bekletilmeden incelenmelidir. Bunun iki açıdan önemi vardır. Birincisi mikroorganizmalar genellikle vücut ısısında daha iyi hareket gösterir. Bekletilmekle hareket azalır. İkincisi ise oksijenin olumsuz etkisi ile hareket kaybolur. (E.histolytica anaerop olup; bekletilirse ölür ve hareket durur )

2- Preparat hazırlanırken lam etüvde bekletilerek ısıtılır.

3- Preparat hazırlanır hazırlanmaz bekletilmeden hemen incelenmelidir.

PREPARATLARIN HAZIRLANMASI VE İNCELENMESİ

İyi boyanmış bir preparat usulune uygun olarak hazırlanan boya çözeltilerinin kullanılması ile mümkün olabilmektedir. İyi bir boya çözeltisi elde edebilmek için dikkat edilmesi gereken bir takım hususlar söz konusudur.

1-Toz boyayı havanda çok iyi ezmek gerekir.

2-Boya hazırlanınca renkli şişelerde ve karanlıkta saklanmalıdır.

3-Boyalar hazırlanınca en az 24 saat oda ısısında bekletilmelidir.

4-Filtreden süzülerek kullanılmalıdır.

Preparatların hazırlanması:

Preparatlar doğrudan hasta örneklerinden, kültürlerden ya da deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanırlar.Kültür katı veya sıvı olabilir; sıvı kültür ise tüp önce çalkalanmalı, sonra uygun temizlenmiş bir lam üzerine bakteri süspansiyonundan bir damla konulmalıdır. Katı besiyeri ise serum fizyolojik veya distile su kullanılabilir. Bakteri sıvıda homojen hale getirilir ve preparat kurumaya bırakılır. Etüvde kurutma yapılabilir. Direkt hastadan alınan örneklerde önce ekim yaptıktan sonra eğer materyal sıvı ise santrifüj edilir. Elde edilen çökeltiden preparat hazırlanır. Eğer örnek doku parçası ise preparat hazırlamak için anaerop enfeksiyon şüphesinde doku steril olarak kesilir, orta kısmından preparat hazırlanır. Aerop mikroorganizmalar için doku homojen hale getirilir. Bu steril petri kutusunda küçük küçük parçalara ayırma ile yapılabilir. Daha sonra preparat hazırlanır.

Tesbit Yöntemleri:

Preparatların tespit edilmesindeki amaç onların lama yapışmalarını sağlayarak tutturmaktır. Bu suretle üzerlerine uygulanacak sıvılarla lamdan ayrılmazlar.

1- Fiziksel tesbit: a)- Alevden geçirme

b)- 18-24 saat oda ısısında bekletme

2- Kimyasal tesbit: Bu tespit yöntemi direkt dokudan hazırlanan preparatlarda ökaryotik hücre yapısının bozulmasını önlemek için yapılır.

a)- Alkol eter karışımı

b)- Metanol ile 3-5 dakika tesbit

c)-Aseton: Özellikle floresan mikroskopisi için hazırlanan preparatlar asetonda 5 dakika tutularak tesbit edilirler.

d)- Absolu alkol ile 8-10 dakika da tesbit yapılabilir.

Ayrıca alkol+aseton karışımı ve başka kimyasal maddelerle tesbit işlemleri yapılabilir.


BOYAMA YÖNTEMLERİ

I-Basit Boyama Yöntemleri:

Bu yöntemlerde genellikle tek bir boya eriyiği kullanılarak boyama yapılır. Mikrorganizmaların morfolojisinin incelenmesi amaçlanır.

a)- Negatif Boyama: Bu yöntemde asidik boya kullanılarak zeminin boyanması amaçlanır.Bu preparatta mikroorganizma boya almaz. Mikroorganizmanın büyüklüğü ve morfolojisi hakkında bilgi edinmek ve spiroketler gibi zor boyanan bakterilerin gözlenmesi amacıyla kullanılır.Çini mürekkebi ya da Nigrosin eriyiği kullanılır.Bir damla çini mürekkebi lamın bir kenarına konur. Bir damla bakteri süspansiyonu ile homojenize edilir ve lama yayılır. Preparat iyice kurutulur. Tesbit işlemi yapılmaz ve immersiyonla mikroskopta incelenir.

b)- Löfflerin Metilen Mavisi kullanılarak yapılan basit boyamada Corynebacterium diphtheriae da daha koyu boyanan metakromatik cisimcikler gözlenebilir.



Herhangi bir bazik boya kullanılarak yapılan basit boyamada bakterin morfolojisi ve büyüklüğü hakkında bilgi edinmek yanında özellikle direkt materyalden hazırlanan preparatın incelenmesiyle materyalin uygun alınıp alınmaması hakkındada fikir edinilir. Bol epitel hücresi varlığı materyalin uygun olmadığını gösterir. Gram boyama kadar etkili olmasada mikroorganizmaların morfolojisi ve mikroskop sahasındaki dizilimi göz önüne alınarak hangi besiyerine ekim yapılacağı hakkında bilgi edinilir.


II-Kompleks Boyama Yöntemleri:

Gram Boyama

En az iki bazik boyanın kullanıldığı boyama yöntemidir. Mikroorganizmaların gram boyamasında etkili olacak mekanizmalar şunlardır:

1- Bakteri hücre yapısı:

a)- Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde Gram negatiflere kıyasla oldukça kalın peptidoglikan tabaka mevcuttur. Bu nedenle aldıkları boyayı alkolle dekolarizasyonda gram negatiflere nazaran daha geç bırakırlar.

b)- Gram pozitif bakterilerin hücre çeperinde karbonhidratlar, gram negatiflerde lipidler fazladır. Karbonhidratlar alkolle dekolarizasyon esnasında dehidratasyona (su molekülü açığa çıkar) uğrar. Porlar iyice büzüşür , daralır ve boya dışarı çıkamaz. Lipitler için ise alkol çözücüdür ve hücre çeperinde olan porlar daha çok açılacaktır.

c)- Gram pozitif hücre çeperinde bulunan teikoik asit, bazik boyalarla daha kuvvetli birleşik oluşmasını sağlar.

d)- Gram pozitif hücre çeperinde bulunan magnezyum ribonucleatın gram boyanmada önemli fonksiyonları vardır.

e)- Bakteri protoplazmasının pH sıda önemlidir.Gram pozitiflerdeki protoplazmanın pH sı daha asidiktir.

2- Bakteri Kültürünün Yaşı:

Genel olarak yaşlanmış kültürden elde edilen preparat gramla negatif boyanma eğilimindedir.

Gram boyamada kullanılan değişik boya çözeltileri vardır. Bu boyaların hazırlandığı çözeltiye göre boyama süresi değişir. ( Toz boya distile su içinde hazırlanırsa Kristal Viole ile boyama 1 dakika iken, amonyum oxalat kullanıldığında kristal viole ile boyamada 30 saniye yeterli olmaktadır.)

Gram boyamada Lugol mordan olarak kullanılmaktadır. Görevi boyanın bakteriye tesbitini sağlamaktır.


Gram Boyama Yönteminin Yararları

1- Mikroorganizmaları gram pozitif ve gram negatif diye iki ana gruba ayırır.

2- Mikroorganizmaların morfolojisi ve dizilimi esas alınarak ön tanı konur. Buna dayanarak nisbeten uygun bir antibiyotik seçilir, izolasyon için uygun besiyeri seçimi yapılır.

3- Örneğin usulüne uygun olup olmadığı hakkında bilgi verir.

4- Anaerop mikroorganizma olup olmadığı hakkında bilgi verir. Aeroplarda üreme yok; fakat mikroskopta polimikrobiyal özellik gözleniyorsa anaerop olduğu anlaşılır.

Devamı için tıklayınız
Tagler: Hiç etiket yok

Comments: (0)

Henüz yorum yapılmamış